西北國(guó)防醫(yī)學(xué)雜志( Med NDFNC)2005Oct.26(5)345論著乙醇脫氫酶法測(cè)定血漿中乙醇伏建峰史清海路西春高華丁艷萍(蘭州軍區(qū)烏魯木齊總醫(yī)院新疆烏魯木齊830000)摘要目的建立一種快速測(cè)定血漿中乙醇濃度的新方法。方法選用三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸Tris-hcl)作為緩沖體系在堿性條件下乙醇脫氫酶(ADH)催化乙醇轉(zhuǎn)化成乙醛同時(shí)生成還原型輔酶I(NADH)在340nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度的變化對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算乙醇的濃度。結(jié)果ADH最適用量為753KU/L輔酶(NAD+)最適濃度為60.0 mmol檢測(cè)過(guò)程僅需90s線性范圍可達(dá)0~68.60mmol/L變異系數(shù)(CV)為2.31%~3.25%回收率為98.4%~101%與美國(guó)DADE試劑盒比較具有良好的相關(guān)y=0.985y=0.987x0.024。結(jié)論本法測(cè)定血漿中乙醇無(wú)需除蛋白具有快速簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)可用于自動(dòng)生化分析儀及手工操作適于臨床常規(guī)運(yùn)用。關(guān)鍵詞:實(shí)驗(yàn)室診斷;乙醇;乙醇脫氫酶;檢測(cè);臨床應(yīng)用中圖分類號(hào):R446.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A文章編號(hào)1007-8622(200505-0345-03 Determination of alcohol in plasma by alcohol dehydrogenase method FU Jian--feng, SHI Qing-hai,luxi-cun,etal.( Urumchi General Hospital of Lanzhou Command,pla80000, China) Abstract :Objective To establish a new method for rapid measuring alcohol( ALC)in plasma. Methods: Tri( hydroxymethyl)aminomethane-hydrochloride-(tris-hcl) buffer was used in this study. In the condition of alkalescence alcohol dehydrogenase( ADH )catalyzed the oxidation of ALC to acetaldehyde with the simultaneous production of deoxidized nicotinamide adenine dinucleotide( NADH ) The variance of absorbance was determined by a filter of 340 nm. The concentration of ALC was calculated according to the standard. Results The most adapt quantity of ADH was 753 KU/L and the best concentration of the NAD* was 60. 0 mmol/L. It cost only 90 s in the whole reaction. The range of linearity was from zero to 68. 60mmol/L. The coefficient of variation (CV)in different concentrations was from 2. 31% to 3. 25%. The recovery rate ranged from 98.4% to 101%. Compared with DADE America) reagents method, the regression equation was obtained. Conclusion: This ADH method for measuring the concentration of ALC in plasma is rapid and simple without removing protein. It could be used both automatically and manually and suitable for clinical application. Key wordsLaboratory diagnosis; Alcohol; Alcohol dehydrogenase; Testing; Clinical application飲酒過(guò)量可引起以神經(jīng)精神癥狀為主的疾病,整個(gè)檢測(cè)過(guò)程僅需90s可用于自動(dòng)生化分析儀及稱為酒精中毒(alcohol poisoning)或乙醇中毒(etha手工操作適于臨床常規(guī)運(yùn)用 nol poisoning一次飲用大量酒類飲料會(huì)對(duì)中樞1原理神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生先興奮后抑制作用重度中毒可使呼選用三(羥甲基)氨基甲烷-鹽酸(Tris-hl)吸心跳抑制而死亡鑒于酒精中毒的后果嚴(yán)重所作為緩沖體系在堿性條件下,乙醇脫氫酶(ADH)以迅速測(cè)定血漿中乙醇濃度對(duì)早期診斷和處理急催化乙醇轉(zhuǎn)化成乙醛,同時(shí)生成還原型輔酶性酒精中毒具有非常重要的臨床價(jià)值。作者報(bào)道一(NADH)。在340nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度的變化對(duì)種新的酶終點(diǎn)法測(cè)定血漿中乙醇濃度,無(wú)需除蛋白,照標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算乙醇的濃度。2材料與方法收稿期2005-06-23346西北國(guó)防醫(yī)學(xué)雜志( Med NDFNC)2005Oct.26(5)ADH16.8mg溶于10ml重蒸水試劑Ⅱnd8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0的Tris-Hcl溶238.8mg溶于6ml重蒸水試劑ⅢTris1070g液結(jié)果顯示pH10.5時(shí)較為適宜同時(shí)確定Tris濃溶于100ml重蒸水檢測(cè)前與0.1mol/LHL按5度為882.9mmol/L:1(V/V)混合。3.5反應(yīng)動(dòng)力學(xué)曲線:選擇低、中、高(17.152.2標(biāo)準(zhǔn)液分別加入100、200、300和4001無(wú)34.30、68.6mmol/L)三個(gè)不同濃度標(biāo)準(zhǔn)血漿用本水乙醇到50ml蒸餾水中制備出的標(biāo)準(zhǔn)液濃度分法在XL上觀察反應(yīng)進(jìn)程圖2結(jié)果表明不同濃度別為17.15、34.30、51.45和68.60mmol/L儲(chǔ)存于的樣品60s內(nèi)吸光度上升最快70~80s曲線平緩,具塞容器中備用。90s后吸光度基本一致因此選擇90s為反應(yīng)終點(diǎn)2.3混合血漿制備采集40位健康體檢者肘部靜時(shí)間。脈血各2 ml NaF抗凝離心后制備混合血漿。2.4標(biāo)準(zhǔn)血漿分別加入20、40、60、80μ1無(wú)水乙醇到10ml混合血漿中混勻制備出的標(biāo)準(zhǔn)血漿濃度分別為17.15、34.30、51.45和68.60mmol/L,以1ml分裝,-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?.5儀器:XL型生化分析儀(美國(guó)杜邦)2.6自動(dòng)分析參數(shù):反應(yīng)類型終點(diǎn)法反應(yīng)溫度:37℃波長(zhǎng)340mm(主)380nm(次)樣品3μl試01003040507081100劑125μl、試劑Ⅱ130ul、試劑Ⅱ340μ反應(yīng)時(shí)圖2ADH法檢測(cè)三個(gè)不同乙醇濃度標(biāo)準(zhǔn)血漿反應(yīng)進(jìn)程曲線間90s3實(shí)驗(yàn)與結(jié)果3.6線性范圍取濃度為0、17.15、34.30、51.45、3.1ADH用量的選擇取ADH(單位KU/L)活性68.60mmol/L的標(biāo)準(zhǔn)血漿用本法測(cè)定,乙醇在0~分別為:27、54、108、215、323、430、538、645、75368.60mmolL范圍內(nèi)線性良好860、968的酶工作液分別測(cè)定高濃度(51.45mmol/3.7精密度試驗(yàn)選擇低中、高(17.15、34.30、L)的乙醇標(biāo)準(zhǔn)液圖1結(jié)果表明,ADH用量在75351.45mmol/L)三個(gè)不同濃度標(biāo)準(zhǔn)血漿用本法重KU/L以上最適。復(fù)測(cè)定20次批內(nèi)變異系數(shù)分別為3.25%、2.31%和2.40%。3.8回收試驗(yàn)在已知乙醇濃度為20.0mmol/L的標(biāo)本內(nèi)分別加入低、中、高三種濃度(17.15、34.30、51.45mmol/L)的乙醇標(biāo)準(zhǔn)液,回收率分別為100%、101%及98.4%3.9干擾試驗(yàn):將同體積蒸餾水和同體積不同濃度的干擾物分別加入到等體積的混合血漿中前者為對(duì)照樣品其余為含不同濃度干擾物質(zhì)的檢測(cè)樣0102003004005006007008000010圖1ADH用量的選擇/L品每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定5次取均值。檢測(cè)樣品與對(duì)照樣品比較,偏差<±5%說(shuō)明該濃度物質(zhì)對(duì)檢測(cè)3.2NA濃度選擇在pH10.5、adH為753KU/L無(wú)顯著干擾。測(cè)定結(jié)果顯示本法至少能去除30條件下觀察NAD+濃度(mmol/L)為10、20、3040、mmol/L的乙醛。此外膽紅素<500umol/L血紅50、60、70、80、90時(shí)對(duì)反應(yīng)進(jìn)程的影響NA+最適蛋白<5g/L、甘油三脂<100mmol/L時(shí)測(cè)定結(jié)果濃度為60.0mmol/L未見(jiàn)明顯干擾。3.3緩沖體系的選擇配制pH9~11的各種緩沖3.10對(duì)比試驗(yàn)選取40份不同乙醇含量的血漿分液甘氨酸-NaOH、h2O4-k2hpO4、naCO3-別用本法與美國(guó)DADE試劑盒對(duì)比測(cè)定結(jié)果經(jīng)回 NaHCO3和Tris-cl等在相同條件下觀察其對(duì)歸分析y=0.985y=0.987x+0.024世租的影響TⅡ1為官111廣市仕tT通慣者0西北國(guó)防醫(yī)學(xué)雜志( Med NDFNC)2005Oct.26(5)347mmol/36例0.5~1.5mmol/L4例交通管理部門下ADH的最適pH值為10.5送檢疑有酒后駕車者27例,血漿乙醇濃度在10.8乙醛是乙醇的氧化產(chǎn)物,其產(chǎn)量增多可抑制~39.0mmol/L平均為21.4mmol/L其中24人最A(yù)DH的活性,試驗(yàn)中當(dāng)乙醛濃度達(dá)30.0mmol/L終承認(rèn)飲過(guò)酒酒后反應(yīng)遲鈍并嘔吐者8例血漿乙時(shí)仍未見(jiàn)其對(duì)ADH有明顯的抑制作用推測(cè)可能醇濃度為20.5~39.7mmol/L酒后昏迷者3例血是Tris-Hcl和乙醛結(jié)合生成一種復(fù)合物且此反應(yīng)漿乙醇濃度分別為55.2、59.1和62.8mmol/L不可逆使乙醛迅速被移走反應(yīng)得以快速進(jìn)行。4討論酶法自動(dòng)分析已經(jīng)普及血中乙醇的酶學(xué)測(cè)定ADH法檢測(cè)乙醇最早由 Hadjiioanno提出并沿法分為兩種乙醇氧化酶法和ADH法。乙醇氧化酶用至今,傳統(tǒng)方法需除蛋白,且反應(yīng)時(shí)間較長(zhǎng)(約法的試劑組成簡(jiǎn)單缺點(diǎn)是特異性差甲醇對(duì)測(cè)定干300s)由于乙醇極易揮發(fā)很難確保其檢測(cè)的準(zhǔn)確擾很大可出現(xiàn)假陽(yáng)性。DH法相對(duì)特異受甲醇性。本法選擇TrisCL作為緩沖體系加之選用或異丙醇的干擾極小5】此外ADH較乙醇氧化酶高活力的ADH促使樣品中有限的乙醇快速轉(zhuǎn)化成更易得到且成本較低因此ADH法更適宜常規(guī)操乙醛整個(gè)檢測(cè)過(guò)程僅需90s且不用除蛋白經(jīng)方作易于推廣應(yīng)用法學(xué)評(píng)價(jià)各項(xiàng)指標(biāo)均較為滿意線性范圍可達(dá)0參考文獻(xiàn):68.60mmol/L變異系數(shù)(CV)為2.31%~3.5%,[1] Bishop ML, DubenEngelkirk JL, Fody EP. Clinical回收率為98.4%~101%,與美國(guó)DADE試劑盒比 chemistry[m]. Fourth Edition, Philadelphia USALippin較具有良好的相關(guān)。 cott Williams Wilkins, 2000.508-610.ADH工作環(huán)境為堿性,甘氨酸-NaOH、[2]建強(qiáng)劉鳳蘭血清乙醇脫氫酶活性測(cè)定及其臨床應(yīng)用J]天津醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)200171)110-111H2PO4-k2HO4、a2CO3- NaHCO33和Tris-cl[3]陳金來(lái),劉毅,郭妹等酶法血清乙醇測(cè)定試劑盒等緩沖體系均可選用。在我們的實(shí)驗(yàn)中甘氨酸-的初步評(píng)價(jià)及臨床意義J]天津醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)20028NaOH、KH2PO4-K2HPO4緩沖體系不甚理想(4)506-508.Na2CO3-NaHCO33和Tris-hcl緩沖體系較為理想,[4 Kubota, Hosoki et al. Complete amino acid由于Na2CO3- NaHCO3緩沖液容易結(jié)晶不利于存 sequence and characterization of the reaction mechanism of儲(chǔ)作者選擇Tris-hcl作為緩沖體系,該緩沖體系 glucosamine-induced- novel alcohol dehydrogenase from含有兩性離子有利于發(fā)揮酶的活力。不同文獻(xiàn)報(bào) Agrobacterium radiobacter( tumefaciens)j] Arch Bio-道的ADH的最適pH值也有很大差別范圍大致為 chem Biophys,2002,398(2)203-2128.8~10.2-41可能由試驗(yàn)條件及ADH的來(lái)源不5]張紅霞鄧振華謝娜等酒后駕車血液呼氣中乙醇同所致作者所選用ADH來(lái)自酵母在本試驗(yàn)條件檢測(cè)方法評(píng)價(jià)J]刑事技術(shù)2003536-39《西北國(guó)防醫(yī)學(xué)雜志》征訂啟事《西北國(guó)防醫(yī)學(xué)雜志》為蘭州軍區(qū)聯(lián)勤部衛(wèi)生部主辦的國(guó)、內(nèi)外公開(kāi)發(fā)行的綜合性醫(yī)藥衛(wèi)生學(xué)術(shù)性期刊是中國(guó)科技論文統(tǒng)計(jì)源期刊已被《中國(guó)科學(xué)引文數(shù)據(jù)庫(kù)》等國(guó)內(nèi)重要數(shù)據(jù)庫(kù)收錄也被美國(guó)化學(xué)文摘(CA)和俄羅斯文摘雜志(JA)收錄,刊出省部級(jí)以上各類基金資助論文及獲獎(jiǎng)?wù)撐恼加休^高比例多次在軍內(nèi)外期刊質(zhì)量評(píng)比中獲獎(jiǎng)本刊刊登軍內(nèi)外醫(yī)務(wù)工作者有關(guān)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、軍事醫(yī)學(xué)、文獻(xiàn)綜述、講座、護(hù)理、衛(wèi)生科技管理等方面的學(xué)術(shù)文章。主要欄目有述評(píng)論著、臨床研究、高原醫(yī)學(xué)、經(jīng)驗(yàn)交流、護(hù)理、綜述、講座衛(wèi)生行政等。我們希望本刊能對(duì)廣大醫(yī)務(wù)工作者有所神益并熱切歡迎對(duì)我刊給予扶持和指導(dǎo)?！段鞅眹?guó)防醫(yī)學(xué)雜志X前身為《蘭后衛(wèi)生》)1979年創(chuàng)刊2002年改為雙月刊大16開(kāi)本80頁(yè)逢雙月末出版,每期定價(jià)10.00元?！段鞅眹?guó)防醫(yī)學(xué)雜志》國(guó)內(nèi)郵發(fā)代號(hào)54101歡迎在當(dāng)?shù)剜]局訂閱也可直接向編輯部訂閱全年70.00元含郵費(fèi))編輯部地址蘭州市小西湖西街98號(hào)郵政編碼730050聯(lián)系遷(0010750