第11卷第3期生物技術(shù)Vol.11 ,No.32001年6月BIOTECHNOLOGYJun 2001中圖分類號(hào):Q93 - 331文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A .文章編號(hào):1004- 311X( 2001 )3- 0021- 03甲醇降解菌的分離及性質(zhì)研究宋志文'陳冠雄' ,馬放2楊基先2( 1.中國(guó)科學(xué)院沈陽(yáng)應(yīng)用生態(tài)研究所遼寧沈陽(yáng)110016 ;2.哈爾濱工業(yè)大學(xué)黑龍江哈爾濱150001 )摘..要對(duì)氮肥廠活性污泥進(jìn)行馴化篩選得到 3株甲醇降解菌,可耐10 00mg/L左右的甲醇濃度實(shí)驗(yàn)得出其最佳生長(zhǎng)條件為pH7~ 8、溫度30C~ 35C、通氣,在適宜條件下對(duì)甲醇有較好的降解能力。關(guān)鍵詞:甲醇降解菌馴化生物降解甲醇作為一種有機(jī)污染物廣泛存在于基測(cè)定0OD5so吸收值。本有機(jī)合成、塑料、人造纖維、制藥、離子交換1.5 細(xì)菌計(jì)數(shù)采用平板菌落計(jì)數(shù)法7]。樹(shù)脂、石油化工、林業(yè)化工及硫酸鹽紙漿等生1.6 申醇的測(cè)定采用氣相色譜法島津GC產(chǎn)廢水中[1。甲醇對(duì)人體和水生生物和微生- 102型氣相色譜儀分析,檢測(cè)器為FID ,檢物均有毒性1。對(duì)于甲醇廢水的處理主要有測(cè)器、進(jìn)樣口、色譜柱的溫度分別為170°C、物理化學(xué)處理方法和生物處理方法231。由190C、180C高純N2作載氣填料為GDX -于申醇的生物可降解性極大,因而生物處理10260目~80目)方法就顯得更為重要456。較高濃度的甲醇對(duì)細(xì)菌有毒害作用,從而影響處理效果。2結(jié)果與分析分離和篩選降解甲醇的高效菌株，是這類廢水生物處理的重要環(huán)節(jié)。本研究采用馴化的2.1 菌株鑒定分離出3株可以以甲醇為唯方法篩選出對(duì)甲醇有較強(qiáng)降解能力的菌株,一生長(zhǎng) 碳源降解甲醇的細(xì)菌編號(hào)為PI、P2為此類廢水的工業(yè)化處理提供微生物基礎(chǔ)。P3根據(jù)細(xì)菌的菌落特征個(gè)體形態(tài),生理生化反應(yīng),按文獻(xiàn)8鑒定為假單胞菌屬細(xì)菌1材料與方法( Pseudomonas sp :2.2菌 株的適宜生長(zhǎng)條件1.1 培養(yǎng)基2.2.1甲醇濃度對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的影響1.1.1 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基:牛肉膏3g/L取3種菌株母液各1ml 分別加入到含有蛋白胨5g/L葡萄糖4g/L氯化鈉5g/L瓊脂不同濃度甲醇的100ml 選擇培養(yǎng)基中,置搖20g/L pH7.0~7.2。床中反應(yīng)72h,取反應(yīng)液進(jìn)行細(xì)菌平板菌落1.1.2選擇培養(yǎng)基:K2HPO40.5g/L計(jì)數(shù)。結(jié)果見(jiàn)表1。KH2PO40.5g/L MgSO40.3g/L ( NH4 )SO4表1甲醇濃度對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的影響. 1.0g/L微量元素液10ml ,pH7.0- 7.2 ,加入.甲醇濃度P1細(xì)菌數(shù)( 10 )P:( mg/L)一定量 甲醇。1.1.3 微量元素液配方:ZnSO40.2g/L、FeS-93.4.4.54.13.3187.64.73.93.7040.5g/L CaCl23 .0g/ L MnSO40.06g/I。1.2菌種的馴化將從某氮肥廠得到的活性403.53.8污泥加到含100ml/L 甲醇的選擇培養(yǎng)基中，773. 92.72.9之后每天按2倍比例加入甲醇,至甲醇濃度.1357.82.62.1為12800mg/L將菌液轉(zhuǎn)移到新配制的選擇3074.30.40.210.18培養(yǎng)基中，重復(fù)馴化2次后_取0.2ml菌液在6418.90.090.0120.07牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上涂平板32C恒溫培12134.50.0330.0041.3生長(zhǎng)條件 :考察不同甲醇濃度、溫度、二從表1中可以看出,3種菌株對(duì)甲醇均pH、供氧狀況、氮源及尿素含量對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐受性,當(dāng)甲醇濃度在93.4mg/L~ 1357 .8mg/L時(shí),細(xì)菌數(shù)量保持在的影響。1.4 細(xì)菌密度測(cè)定:以空白培養(yǎng)基作對(duì)照,106數(shù)量級(jí)隨著甲醇濃度的提高,細(xì)菌數(shù)有所下降,在甲醇濃度高達(dá)12134 . 5mg/L時(shí)仍收稿日期2001 - 01- 02 ;修回日期2001-04- 03有一定數(shù)量的菌株存活。作者簡(jiǎn)介宋志文( 1966- ),男博士生工程師,從事工2.2.2培養(yǎng)時(shí)間對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的影響:取3種業(yè)廢水的生物處理、環(huán)境微生物學(xué)研究發(fā)表論文4篇。菌株母液各1ml 分別加到含有甲醇200mg/LpH7.0的100ml 選擇培養(yǎng)基中329C搖床22生物技術(shù)第11卷第3期培養(yǎng),每隔一定時(shí)間取樣測(cè)反應(yīng)液0ODo值，329培養(yǎng)箱和 120r/min搖床上培養(yǎng)72h后，結(jié)果見(jiàn)圖1。 .取樣測(cè)定0OD5so值結(jié)果見(jiàn)圖4。0350.4[0.33t0.25口靜置■振蕩)2 F80.150.10.051224364860728496108時(shí)間(b)PP2蘭株圖1培養(yǎng)時(shí)間對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的影響從圖中可以看出3種菌株的生長(zhǎng)曲線圖4供氧狀況對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的影響不同,P1、 P2、P3進(jìn)入穩(wěn)定期的時(shí)間分別為從圖中可以看出振蕩培養(yǎng)的細(xì)菌生長(zhǎng)明60h、36h和36h ,在穩(wěn)定期持續(xù)的時(shí)間分別為顯好于靜置培養(yǎng)的細(xì)菌說(shuō)明分離的菌株生36h、24h和36h。長(zhǎng)要在好氧條件下進(jìn)行,因此在實(shí)踐中應(yīng)用2.2.3培養(yǎng)溫度對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的影響:取3種.這些菌株處理甲醇廢水或進(jìn)行甲醇污染的現(xiàn)菌株母液各1ml 分別加到含有200mg/L 甲場(chǎng)修復(fù)需要保持良好的通氣(曝氣條件,否醇、pH7.0的選擇培養(yǎng)基中在不同溫度下?lián)u則將影響菌株的生長(zhǎng)。，床反應(yīng)72h測(cè)反應(yīng)液ODso值結(jié)果如圖2所2.2.6不同氮源對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的影響:取3種示。結(jié)果表明3株細(xì)菌均為中溫菌,在159 .菌株母液各1ml,分別加到含有不同氮源的~40C范圍內(nèi)溫度對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)影響相對(duì)氮源培養(yǎng)基中在適宜條件下培養(yǎng)72h取樣測(cè)定ODs5結(jié)果見(jiàn)圖5。結(jié)果表明,3株細(xì)菌較小最適生長(zhǎng)溫度為30°C~35°C。的最佳氮源是牛肉膏,P1 和P3的次佳氮源2.2.4 培養(yǎng)基初始pH對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的影響:是尿素P2的次佳氮源是硝酸銨。取3種菌株母液各1ml分別加到含有200mg/L甲醇、不同pH的100ml選擇培養(yǎng)基中置圈P10P2于搖床中32C條件下反應(yīng)72h結(jié)果見(jiàn)圖3。OP30.4 [0.20.350.15P30尿素硫酸銨 硝酸銨.硝酸鈉牛肉膏圖5不同氮源對(duì)細(xì) 菌生長(zhǎng)的影響1520 2530 3510 溫度2.2.7_尿素含量對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的影響:取3種.菌株母液各1ml 分別加到含有不同含量尿.圖2培養(yǎng)溫度對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的影響素的100ml選擇培養(yǎng)基中,在適宜條件下反應(yīng)72h取樣測(cè)定0OD6o值結(jié)果見(jiàn)圖6。.).25 [0.→P1-P2--P0:。00.4P 0.389pH0.5圖3培養(yǎng)基 pH對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的影響尿素含量(%)從圖中可以看出3株菌生長(zhǎng)的最適pH為7~8 ,P1對(duì)pH比P2、P3更敏感過(guò)酸或過(guò)圖6尿素含量對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的影響堿均不利于菌體生長(zhǎng)。從圖中可以看出,低含量尿素( 1% ~2.2.5供氧狀況對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的影響:試驗(yàn)是2%)對(duì)3種菌株的生長(zhǎng)均有很大的促進(jìn)作以搖床培養(yǎng)作為好氧靜置作為缺氧條件進(jìn)用。在氮肥廠合成氨生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)生的甲醇行的取3種菌株母液各1ml分別加到含有廢水中通常含有少量的尿素[9。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果200mg/L用數(shù)糖l7.0的選擇培養(yǎng)基中,在來(lái)看1%~2%含量的尿素可作為細(xì)菌生長(zhǎng)第11卷第3期生物技術(shù)Vol.11 ,No.32001年6月BIOTECHNOLOGYJun 2001的氮源促進(jìn)細(xì)菌的生長(zhǎng)。P3進(jìn)入穩(wěn)定期的時(shí)間分別為60h、36h和2.3降解甲醇的能力36h在穩(wěn)定期持續(xù)的時(shí)間分別為36h、24h和取3株細(xì)菌母液各1ml分別加入到含有36h 3株細(xì)菌的最適生長(zhǎng)條件為_(kāi)pH7 ~ 8、不同濃度甲醇的100ml 選擇培養(yǎng)基中,在適30°C ~ 35°C、振蕩培養(yǎng),最佳氮源是牛肉膏_宜條件下反應(yīng)12h測(cè)定甲醇含量,計(jì)算甲醇少量尿素(1%~2%對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)有很好的促降解率結(jié)果見(jiàn)圖7。進(jìn)作用在適宜條件下，當(dāng)甲醇濃度< 300mg/100L時(shí)3株細(xì)菌對(duì)甲醇降解率均很高,經(jīng)12h降解率在80%以上。隨著甲醇濃度加大降80解能力也隨之降低,在低濃度甲醇條件下3株細(xì)菌對(duì)甲醇的降解能力基本相同,在高濃度條件下,P1對(duì)甲醇的降解效果明顯好于P2、P3。根據(jù)菌株的性質(zhì)有可能將其投加到活性污泥或生物膜中處理甲醇廢水，從而為甲醇廢水的生物處理提供微生物學(xué)基礎(chǔ)。筆93 188 40.4 77.4 135.8 307.4 641.9 1213.5者將分離篩選的菌株固定在顆?；钚蕴?ZJ甲醇含量(m/L)- 15 )上處理輕度污染甲醇廢水取得了一 定效果10]圖7細(xì)菌對(duì)甲醇的降解能力參考文獻(xiàn):從表中可以看出在甲醇濃度< 300mg/L[1I蘇JM.格魯什科.工業(yè)廢水中有害有機(jī)化合物手冊(cè)時(shí)3株細(xì)菌對(duì)甲醇降解率均很高,在80%以[MI北京化學(xué)工業(yè)出版社: 1988 208 -211.[2馮錫康主編。有機(jī)化工廢水治理技術(shù)[ M].北京:化學(xué)上。隨著甲醇濃度加大,降解能力也隨之降[3趙洪波.國(guó)內(nèi)甲醇廢水處理技術(shù)應(yīng)用現(xiàn)狀[J]化工環(huán)工業(yè)出版社低在低濃度甲醇條件下3株細(xì)菌對(duì)甲醇的保,1998 ,18(6):154~ 157.降解能力基本相同,在高濃度條件下,P1 對(duì)[4 Novak J T C D ,Benoit，et al . Biodegradation of methanol and甲醇的降解效果明顯好于P2、P3。tertiary butyl alcohol in subsurface systems[ J ] Water Sci._Technol.1985 ,17 71~ 85.[ 5 ]Anthony C.The _oxidation of methanol in gram - negative bacte-3結(jié)論nid J ] FEMS Microbiology Reviews. 1990 87( 3-4 ):209~ 214.[ 6 ]Kinagata K. Systematics of methanol - utilizing bacteria[ J ].從氮肥廠活性污泥中分離出3株能夠以7 BMicrobicly Reivcs9087 3-4)0122出甲醇為唯一碳源降解甲醇的細(xì)菌，編號(hào)為[7祖若夫等，微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教程M jP1、P2、P3經(jīng)鑒定均為假單胞菌屬細(xì)菌，這3版社,1993 :株細(xì)菌可在10 000mg/L的甲醇濃度中存活。;8中國(guó)科學(xué)院微生物研究所細(xì)菌分類組編著.一般細(xì)菌常用鑒定方法M 1.北京科學(xué)出版社1978 :135 ~ 194試驗(yàn)表明3種菌株的生長(zhǎng)曲線不同,P1、P2、: 9國(guó)家環(huán)境保護(hù)局石油石化工 業(yè)廢水治理M].北京:中國(guó)環(huán)境科學(xué)出版社.1992 :461 - 535[10宋志文陳冠雄,馬放。微生物固定化處理甲醇廢水的實(shí)驗(yàn)研究J]微生物學(xué)雜志2000 244 )30~31.Isolation and characterization of bacteria capable of degradingmethanolSONG Zhi- wen' CHEN Guan- xiong' ,MA Fang2 ,YANG Ji - xian2( 1. Institute of Applied Ecology Academia Sinica Shenyang 110016 ;2. Harbin Institute of Technology Harbin 150001 China )Abstract :Three strains of bacteria which can highly degrade methanol have been obtained by enriching ,screening and acclimatizing the strains in active sludge gotten from a fertilizer factory . These bacteria cantolerate methanol of 10 ,000mg/L ,The optimum culture conditions are pH7 ~ 8 30C ~ 35C and aera-tion. At th5op麴據(jù)n conditions their degrading capacities are very efficient.Key words imethanol degrading bacteria jacclimatization ;biodegradation