第26卷第4期湖北大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)Vol.26 No.42004年12月Joumal of Hubei Universit( Natural Science Edition )Dec.2004文章編號:1000- 23752004 )4-0322 - 05聚賴氨酸-聚乙二醇-聚賴氨酸與DNA聚離子復(fù)合物膠束的研究楊子剛'周芬'袁建軍'，馬立新2,翟超2程時遠(yuǎn)'( 1.湖北大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院湖北武漢A30062 2. 湖北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院湖北武漢A430062 )摘要將聚(N- 芐氧羰基賴氨酸)-聚乙二醇-聚( N--芐氧羰基賴氨酸I PL(Z)- PEG- PL(Z))沖的氨基去保護(hù)得到兩端為聚陽離子的嵌段共聚物聚賴氨酸-聚乙二醇-聚賴氨酸( PLL- PEG- PLL)并對其與DNA結(jié)合形成的聚集體的性質(zhì)進(jìn)行了研究.結(jié)果表明:PLL- PEG-PLL與DNA形成了聚離子復(fù)合物膠束;DNA與PLL通過靜電作用形成核,PEC包裹在其外面得到的聚離子復(fù)合物膠束為均相體系即使在化學(xué)計量點(diǎn)也不會沉淀,保持著很好的流動性和穩(wěn)定性這--點(diǎn)對基因治療是很重要的而且隨著PLL段的增加,包覆效果更好聚離子復(fù)合物膠束使得DNA具有較強(qiáng)的核酶抗性;大小在10~35nm之間呈球形聚離子復(fù)合物膠束能夠用于基因的傳遞使基因在昆蟲細(xì)胞系SF9中能夠表達(dá)出蛋白質(zhì).關(guān)鍵詞聚賴氨酸聚乙二醇嵌段共聚物;DNA聚離子復(fù)合物膠束中圖分類號:0647.2文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A隨著人類基因圖譜的繪制完成在不久的將來人類的所有疾病都有可能通過基因進(jìn)行治療.然而,其中一個主要的問題就是基因載體的開發(fā),目前,用于基因治療的載體主要是病毒病毒雖然具有轉(zhuǎn)染效率高的特點(diǎn)但是它存在-個致命的弱點(diǎn)那就是與人體的相容性不好會產(chǎn)生免疫原性存在嚴(yán)重的安全問題1].與病毒載體相比非病毒載體具有無傳染性、不限制載體容量.可大量制備等優(yōu)點(diǎn)而越來越受到研究人員和臨床醫(yī)生的關(guān)注.因此非病毒基因載體的研究成為當(dāng)前的一個研究熱點(diǎn).目前非病毒基因載體主要是聚陽離子[2-8]存在在化學(xué)計量點(diǎn)時易沉淀的問題不能保證足夠的流動性聚陽離子過量又會產(chǎn)生毒副作用.本文中利用聚賴氨酸與聚乙二醇的三嵌段共聚物與DNA結(jié)合,由于形成的復(fù)合物的外面包裹PEG ,即使在化學(xué)計量點(diǎn)時也不會產(chǎn)生沉淀.1實(shí)驗(yàn)部分1.1主要試劑PLI(Z)-PEG-PLI(Z按文獻(xiàn)9]合成.胰蛋白酶Trypsin):E0C0311武漢亞法生物技術(shù)公司;Dnase [ Deoxyribonuclease I ) :Code D2210 ,TaKaRa 33 %溴化氫乙酸溶液,ACROS Co.質(zhì)粒DNA :FGgH- FGgH(5.5 kb )按文獻(xiàn)10抽提.1.2 主要儀器紅外光譜用Perkin - Elmer Spectrum one型紅外光譜分析儀(美國) ,KBr壓片. 'HNMR測試采用美國Varian公司INOVA-600型核磁共振光譜儀,以重水為溶劑.熒光光譜采用ShimadzuDATARecorderDR-3型熒光光譜儀激發(fā)波長為527nm發(fā)射波長為585nm.紫外光譜采用PekinEImerλ-17型紫外可見光譜儀.測量波長為260nm時對應(yīng)的OD值.TEM測試采用H-7000FA(HTTACH)型透射電子顯微鏡TEM )加速電壓為80kV .制樣時先在銅網(wǎng)上敷-層富爾膜再在膜上噴涂碳膜輕輕滴一滴樣品溶液迅速吸干真空干燥后進(jìn)行TEM測試原子力顯微鏡將一點(diǎn)樣品輕輕滴加到玻璃上,自然風(fēng)干然后在NS3a型原子顯微鏡下觀察.凝膠成像系統(tǒng):U中國煤化工.激光共聚焦顯微鏡:LEICA公司TCS SP2型.TYCNMHG收稿日期2004-06- 12.基金項目湖北省高分子材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室基金作者簡介楊子剛1977- )男 碩士程時遠(yuǎn)通訊聯(lián)系人E - mail scheng@ publie . wh. hb. cn第4期楊子剛等聚賴氨酸-聚乙二醇-聚賴氨酸與DNA聚離子復(fù)合物膠束的研究3231.3實(shí)驗(yàn)步驟1.3.1 聚賴氨酸-聚乙二醇-聚賴氨酸PLL- PEG- PLL )的合成 向一 定量的聚( Ne -芐氧羰基賴氨酸)-聚乙二醇-聚(Ne-芐氧羰基賴氨酸)中加入33%的溴化氫的乙酸溶液,10min后變?yōu)橥该鞯娜芤豪^續(xù)反應(yīng)又慢慢變渾濁50 min后停止反應(yīng).將反應(yīng)液倒入-定量的無水乙醇中沉淀,過濾再用無水甲醇溶解再用無水乙醇沉淀過濾真空室溫抽干.1.3.2 聚賴氨酸-聚乙二醇-聚賴氨酸與DNA聚離子復(fù)合物膠束的制備 聚賴氨酸-聚乙二醇-聚賴氨酸和DNA分別用pH7.4的Tris - HCl緩沖溶液配制成一定濃度的溶液 聚賴氨酸-聚乙二醇-聚賴氨酸所帶正電荷按照其中賴氨酸的聚合度與物質(zhì)的量的乘積計算,DNA所帶的負(fù)電荷由其中堿基的個數(shù)與DNA物質(zhì)的量的乘積計算,因?yàn)閴A基與DNA分子中提供負(fù)電荷的磷酸基團(tuán)的數(shù)目是-致的.然后配制成-系列不同電荷比的復(fù)合物在所有的實(shí)驗(yàn)中DNA的最終濃度都控制為15mg/L.用于聚離子復(fù)合物大小和形態(tài)的研究.1.3.3 聚離子復(fù)合物膠束的熒光分析 將溴化乙錠按照EB: DNA的質(zhì)量比1:5加入到聚離子復(fù)合物膠束中避光放置12 h然后用熒光光譜儀進(jìn)行測試.1.3.4 聚離子復(fù)合物膠束對脫氧核糖核酸酶I的抗性按下列配方進(jìn)行酶切實(shí)驗(yàn):脫氧核糖核酸酶Ibuffer2μuL聚離子復(fù)合物膠束10山脫氧核糖核酸酶0.2山用雙蒸水加到總體積為20山25°C酶切80min后80 C水浴加熱使脫氧核糖核酸酶失活然后加入40μL1 %的胰蛋白酶瞬時離心后置于37 C水浴中30 min再加入60 puL異戊醇/氯仿1:24 V/V )溶液.12000 r/min離心5 min取上層液加入3pμL3mol/L乙酸鈉溶液,100μxL無水乙醇AC放置40min.12000r/min離心10min去掉液體,37C恒溫烘干再加入20p山Tris-HCl溶液電泳觀察用凝膠成像系統(tǒng)拍照.1.3.5轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)使用無抗生素的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞待細(xì)胞密度達(dá)到90%~95%在100puL無血清的SFM培養(yǎng)基中加入10yuL的DNA形成SolutionA另100pμ無血清的SFM培養(yǎng)基中加入100pμ的嵌段共聚物形成Solution B分別輕輕混勻?qū)⑷芤篈和B混合后.27 °C溫育30~45 min然后補(bǔ)加800 pu山的SFM將上述1mL混合液加入到細(xì)胞培養(yǎng)平板(己用2mL無血清培養(yǎng)基洗過一次)中使分布均勻27C培養(yǎng)4~6h后吸去以上加入的1 mL混合液再加入3 mL完全培養(yǎng)基(含血清)培養(yǎng)72 h后用激光共聚焦顯微鏡觀察.2結(jié)果與討論2.1聚賴氨酸-聚乙二醇-賴氨酸的制備聚賴氨酸-聚乙二醇-聚賴氨酸按schemel步驟由聚(N∈-芐氧羰基賴氨酸)-聚乙二醇-聚( N-芐氧羰基賴氨酸)氨基去保護(hù)生成,去保護(hù)是在33 %的溴化氫的乙酸溶液中進(jìn)行的同時反應(yīng)條件要求無水無氧.從紅外光譜圖,1 705 cm-l處沒有羰基的特征吸收峰,從而證明芐氧羰基的去除.圖1是聚合物的'HNMR化學(xué)位移的歸屬為3.62 - CH2-CH2-0- ),3.08( δ-CH2 ),1.62~1.71( (CH2)- )未見有苯環(huán)上質(zhì)子的化學(xué)位移，從而可以確定芐氧羰基已經(jīng)完全除去.另外有3.62 - CH- -CH2-o- )3.08( δ- - CH2 )對 應(yīng)的積分值計算出聚合物的組成結(jié)果聚合度沒有變化,由此可見在去保護(hù)過程中不會發(fā)生聚合物鏈的斷裂.H( NHCHOC )，NHCH2CH( 0CH2CH2 )mOCH2CH2NH( COCHNH ),HR33 % HBCHgCOOHH( NHCHOC ) NHCH2CH( 0CH2CH2 )0CHLCHNH_ COCHNH ),H中國煤化工MHCNMHGR =( CH2 2NHC00CH2-R2 =( CH2 )NH2Schemel聚賴氨酸 -聚乙二醇-聚賴氨酸的合成路線324湖北大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)第26卷2.2嵌段共聚物膠束介 導(dǎo)基因傳遞的一般過程在生理條件下,DNA是帶負(fù)電荷的柔性大分子沒有外力或載體的作用是很難穿過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞的當(dāng)嵌段共聚物的陽離子部分與帶負(fù)電的DNA分子形成聚離子復(fù)合物膠束( polyion complex micelle )后其尺寸明顯減小可以通過細(xì)胞內(nèi)吞或吞噬作用進(jìn)入細(xì)胞在細(xì)胞內(nèi)緊密的復(fù)合物可以保護(hù)DNA避免核酸酶的降解.圖2是聚離子復(fù)合物膠束介導(dǎo)的基因傳遞的一般過程.在DNA進(jìn)入細(xì)胞之前,DNA與嵌段共聚物首先復(fù)合形成緊密的聚離子復(fù)合物膠束聚離子復(fù)合物膠束通過胞吞途徑進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)在其中會與內(nèi)體、溶酶體結(jié)合，通常情況下內(nèi)體和溶酶體的pH值( pH值為5.5 )和酶-般會導(dǎo)致進(jìn)入其中的DNA的降解但是pH5~ 7范圍內(nèi)具有較高緩沖能力的聚陽離子能夠與內(nèi)體中質(zhì)子結(jié)合導(dǎo)致內(nèi)體的滲透壓升高,內(nèi)體的膜更容易破裂聚離子復(fù)合物膠束會從內(nèi)體逃逸.聚離子復(fù)合物膠束從內(nèi)體中逃逸進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)在細(xì)胞質(zhì)中擴(kuò)散到細(xì)胞核的模上然后進(jìn)入細(xì)胞核在那里DNA轉(zhuǎn)錄成RNA后翻譯成蛋白質(zhì)行使功能.2.3 DNA 濃度的測定先將抽提 出的質(zhì)粒DNA用Tris - HCI緩沖溶液稀釋再用紫外分光光度計測出波長為260 nm時的吸收值然后按照1 0D260 = 50 mg/L雙鏈DNA的比例計算出DNA的濃度.2.4聚賴氨酸- 聚乙二醇-聚賴氨酸對DNA的包覆本文討論 了聚合物1( PLL20- PEG - PLL20 )和聚合物2X PL12 - PEG- PLL12 )對質(zhì)粒DNA FGgH - FGgH的包覆能力包覆結(jié)果通過溴乙錠( ethidium bromide ,EB )的熒光強(qiáng)度來檢測.不圖3是同電荷配比的聚合物/DNA/EB體系的熒光光譜圖縱坐標(biāo)為相對于DNA/EB體系的熒光強(qiáng)度橫坐標(biāo)為電荷比.當(dāng)向DNA/EB體系中逐漸加入聚合物時隨著電荷比的增加熒光強(qiáng)度先急劇減小然后達(dá)到一恒定值.這3.5 2.5~ 15是因?yàn)镋B是一種陽離子熒光染料能夠強(qiáng)烈而又特異性地與雙螺旋的DNA相互作用當(dāng)EB分子的菲啶環(huán)插入到DNA54的雙螺旋堿基對之間阻止了溶液中水分子通過質(zhì)子轉(zhuǎn)移而圖1 PLL- PEG - PLL的核磁共振譜使激發(fā)態(tài)EB分子的能量損失，從而EB的熒光強(qiáng)度很大.當(dāng)向體系中逐漸加入聚合物時,帶正電荷的聚合物與DNA結(jié)UptakeEndoeytosis合將EB置換出來. 然而,在Tris- HCI緩沖溶液中激發(fā)態(tài)的EB經(jīng)過-個非輻射衰減過程這時激發(fā)態(tài)EB的一個氨基E'scape質(zhì)子被轉(zhuǎn)移給溶劑，從而導(dǎo)致其熒光強(qiáng)度下降.; Endoneoine以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明了聚合物能夠包覆DNA形成聚離子Disociation復(fù)合物膠束:DNA 與PLL通過靜電作用形成核PEG包裹在Nuclear Entry其外面外觀上聚離子復(fù)合物膠束為均相體系即使在化學(xué)計量點(diǎn)也不會沉淀保持著很好的流動性和穩(wěn)定性.同時比較圖圖2基因傳遞示意圖3中的2條曲線,可以看出對于聚合物1 ,達(dá)到熒光值穩(wěn)定的電荷比趣100為1.1;對于聚合物28C照8(則為1.3 ,這是由于部60分正電荷包裹在里面不健40能有效的與DNA結(jié)合中國煤化工的緣故.從曲線還可以愁20MYHCNMHG看出:隨著PLL段的增0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.00.0 0.51.01.52.0253.0加即陽離子段的增加，聚合物1與DNA的電荷值聚合物2勺DNA的電荷值對DNA的包覆效果要圖3電荷比對 EB熒光強(qiáng)度的影響好一些.第4期楊子剛等聚賴氨酸-聚乙二醇-聚賴氨酸與DNA聚離子復(fù)合物膠束的研究3252.5聚離子復(fù) 合物膠束對核酶的抗性圖4是電泳后用凝膠成像拍攝的照片，從左到右第1道為聚合物2與DNA復(fù)合物.經(jīng)核酶處理后的電泳帶第2道為聚合物1與DNA復(fù)合物經(jīng)核酶處理后電泳帶;DNA經(jīng)核酶處理后的情況如第3道第4道為沒有用核酶處理的DNA;第5和第6道分別是化學(xué)計量比時聚合物1/DNA和聚合物2/DNA未經(jīng)核酶處理的情況.從圖可以看出用聚合物包覆的DNA經(jīng)核酶處理后帶的強(qiáng)度與純DNA基本相同,說明DNA的濃度基本沒變聚離子復(fù)合物膠束對核酶有很好的抗性(帶1、2) ,而沒有用聚合物包覆的DNA則完全降圖4 DNA 的電泳圖.解了(帶3).化學(xué)計量比的聚離子復(fù)合物因?yàn)殪o電荷為零在電泳條件下不會發(fā)生移動,另外由于其中的DNA被聚合物包覆,EB不能插入DNA的堿基對之間,因此電泳時不會顯示出DNA對應(yīng)的電泳帶.2.6 聚離子復(fù)合物膠束形態(tài)、大小圖5是聚合物1與DNA形成的聚離子復(fù)合物膠束的原子力顯微鏡圖片從圖可以看出:聚離子復(fù)合物膠束呈球形其大小為10~ 35 nm.圖6是同一聚離子復(fù)合物膠束未經(jīng)染色的透射電鏡的照片,圖7是經(jīng)過圖5聚離子 復(fù)合物膠束的AFM2.0 %的乙酸鈾染色的電鏡照片,從上述兩圖可以看出聚離子復(fù)合物膠束主要呈球形其中有少量的橢球形大小也在10~ 35 mm之間與原子力圖片一致;另外圖7中球形離子的核部分要比外圍部分顏色較深這是因?yàn)橐宜徕櫴荄NA的染色劑,而對聚合物不染色,DNA經(jīng)乙酸鈾染色后顏色加深所以出現(xiàn)上述情況.同時可以證明DNA是被聚合物包裹在里面的.形成的聚離子復(fù)合物大小很好地滿足了用于基因治療的載體在人體中流動的需要11].圖6聚離子 復(fù)合物膠束的TEM圖7聚離子復(fù)合物膠束的TEM圖8轉(zhuǎn)染后的激光共聚焦顯微鏡圖片( x50000未染色)( x 100000 2.0 %乙酸油染色pH4.5)2.7轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)圖8是聚合物1與DNA形成的聚離子復(fù)合物膠束轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞系SF9后用激光共聚焦顯微鏡拍攝到的圖像.從圖中可以看出:聚離子復(fù)合物膠束能夠介導(dǎo)DNA的傳遞并且使DNA在生物體中表達(dá)出相應(yīng)的蛋白質(zhì)圖中出現(xiàn)綠色這與我們使用的DNA有關(guān)因?yàn)槲覀兪褂玫腄NA中含有綠色熒光蛋白(GFP)基因,它表達(dá)出蛋白質(zhì)具有熒光效應(yīng)YH中國煤化工現(xiàn)綠1色.因而說明DNA能夠在生物體中表達(dá)生成相應(yīng)的蛋白質(zhì).同時證明形成CNMHGA的活性沒有影響其中的DNA是具有生物活性的.3結(jié)論P(yáng)LL- PEG- PLL與DNA形成的聚離子復(fù)合物膠束滿足了基因傳遞的基本條件聚離子復(fù)合物膠束326湖北大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)第26卷使得DNA具有較強(qiáng)的核酶抗性，大小在10~ 35 nm之間呈球形聚離子復(fù)合物膠束能夠用于基因的傳遞使基因在昆蟲細(xì)胞系SF9中能夠表達(dá)出蛋白質(zhì).參考文獻(xiàn):[ 1 ]Maureen D B Andreas G s , ljeoma F U. Gene delivery with synthetic( non virl )carrierC J]. International Joumal of Pharmaceu-tics 2001 229 :1 ~21.[2]Godbey W T ,Wu K K , Mikos A G. Pols( ethyenimine ) and its role in gene deliven[ J].J Control Release ,1996 60 :149 ~ 160.[ 3 ] Mannisto M , Vanderkerken S , Toncheva V et al. Structure - activity relationships of poly( L - lysines ): efects of pegylation andmolecular shape on physicochemical and biological properties in gene deliver[ J ].J Control Release 2002 83 :169~ 182.[4] Itaka K , Yamauchia ,K , Harada A et al. Polyion complex micelles from plasmid DNA and pols( ethylene glycol)- pols( L - ly-sine ) block copolymer as serum - tolerable polyplex system physicochemical properties of micelles relevant to gene transfection ffi-cienc[ J ]. Biomaterials 2003 24 :4495 ~ 4506.[5]WangJ ,Mao H Q ,Leong K w. A novel biodegradable gene carrier based on polyphosphoste[J]J Am Chem Soc ,200 123 :9480 ~ 9481.[6]Lim,D W ,YeomYI ,Park TG. Pol( DMAEMA- NVP)- b - PEG - galactose as gene delivery vectors for heptocyte[ J ]. Bio-conj Chem 2000 ,11 5688 ~ 695.[7]Truong L V L ,Walsh s M Schweibert E. Gene transfer by DNA - Gelatin nanosphere{ J ]. Arch Biochem Biophys 1999 361 47 ~56.[8]Pack ,D W，Putnam D , Langer R. Design of imidazole - containing endosomolytic biopolymers for gene deliven[ J ]. BiotechnolBioeng 2000 67 217~ 223.. [9]楊子剛袁建軍程時遠(yuǎn).聚( NE -芐氧羰基賴氨酸)-聚乙二醇-聚( NE -芐氧羰基賴氨酸的合成與表征J ].應(yīng)用化學(xué)2004 6637~ 640.. [ 10]薩姆布魯克J弗里奇EF曼尼阿蒂斯T.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南M]第2版. 金冬雁黎孟楓.北京科學(xué)出版社2002.19~ 22.[ 11 ] Kakizawa Y , Kataoka K. Block copolymer miells for delivery of gene and related conpoundC J ]. Advanced Drug Delivery Re-views 2002 54 203 ~ 222.Studies on polyion complex micelle consisting of poly( L一lysine )- poly( ethyleneglycol )- poly( L - lysine )and DNAYANG Zi-gang' ZHOU Fen' ,YUAN Jian-jun' MA Li-xin2 ZHAI Chao2 ,CHENG Shi-yuan?( 1. School of Chemistry and Material Science , Hubei University , Wuhan 430062 China ;2. School of Life Science , Hubei University , Wuhan 430062 China)Abstract PLL - PEG - PLL were obtained by deprotetion of amino of PLI( z)- PEG- PLI( z). The proper-ties of polyion complex micelle ( PIC ) which consists of PLL- PEG- PLL and DNA were investigated. It showed :PLL- PEG- PLL could condense DNA , larger PLL were generally more effective at condensation ; the system is ho-mogenous and can not precipitate even under charge - neurtralized condition. Remarkable increase in the nucleaseresistance of DNA through the incorporation into the core of PIC ;PIC were spherical , the size were 10~ 35 nm. PICcan apply to gene delivery and the DNA can express in the cell line SF9 .Key words :poly( L - lysine ) ipoly( ethylene glycol ) ;block copolymer ; DNA ; polyion complex miell( PIC )(責(zé)任編輯游俊)中國煤化工MHCNMHG