第35卷第2期溫州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)Vol.35 No.22005 年4月Journal of Wenzhou Medical CollegeApr.2005綜述疆RNA干擾技術(shù)俞富軍，陳永平(溫州醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院感染內(nèi)科，浙江溫州325000)[關(guān)鍵詞] RNA干擾; 基因沉默;雙鏈RNA[中圖分類(lèi)號(hào)]R 459.5[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B [文章編號(hào)] 1000-2138 (2005) 02- 0168-03在基因治療領(lǐng)城里，繼反義RNA、核酶和三鏈DNA基本作用模式最近得到實(shí)驗(yàn)證明。技術(shù)之后，現(xiàn)在又掀起了RNA干擾技術(shù)，這項(xiàng)技術(shù)在第一種模式: Dicer和Sicer依賴(lài)模型。這種是2002年度里榮登美國(guó)著名“科學(xué)”雜志評(píng)選出的世界十人們用果蠅胚胎細(xì)胞及培養(yǎng)細(xì)胞s2作為研究對(duì)象發(fā)現(xiàn)大科技進(jìn)展之榜首，現(xiàn)將有關(guān)RNA干擾技術(shù)作一一介紹。的，它主要包括四個(gè)步驟:①長(zhǎng)的雙鏈RNA在導(dǎo)入細(xì)胞后首先被剪切為長(zhǎng)度21 ~25個(gè)核苷酸的雙鏈RNA分子，1 RNA 干擾的定義和發(fā)展即小干擾RNA，在這一步驟中，Dicer 參與對(duì)雙鏈RNA .RNA干擾是指一種雙鏈RNA分子在mRNA水平上關(guān)的剪切作用。②小干擾RNA與一種蛋白復(fù)合物相結(jié)合，閉相應(yīng)序列基因的表達(dá)使其沉默的過(guò)程,是- -種序列特這種蛋白復(fù)合物含有一個(gè)小干擾RNA分子和一個(gè)蛋白核異性的轉(zhuǎn)錄后基因沉默機(jī)制。1995年康奈爾大學(xué)郭博酸酶分子。目前這種酶分子已被分離出來(lái)，有人將它命士在試圖阻斷秀麗新小桿線蟲(chóng)par21基因表達(dá)時(shí)意外發(fā)名為Sl1icer.③在小干擾RNA的指導(dǎo)下，蛋白復(fù)合物現(xiàn)了RNA干擾現(xiàn)象川。給對(duì)照實(shí)驗(yàn)組線蟲(chóng)注射正義RNA,產(chǎn)形成了一種有活性的RNA誘導(dǎo)的基因沉默復(fù)合物。④在生與反義RNA同樣的結(jié)果一特異性阻斷 該基因的表達(dá)，少量或沒(méi)有ATP參與的情況下,基因沉默復(fù)合物識(shí)別與這一與反義RNA技術(shù)傳統(tǒng)認(rèn)知相矛盾的現(xiàn)象直到1998小干擾RNA具有同源互補(bǔ)序列的靶mRNA，并對(duì)靶mRNA年才有了新的解釋?？突芯吭篎ire等發(fā)現(xiàn)，正義進(jìn)行剪切而產(chǎn)生RNA干擾作用。RNA和過(guò)去反義RNA對(duì)基因表達(dá)的阻斷都是由體外轉(zhuǎn)錄第二種模式:隨機(jī)降解PCR模式。這種模式的作用制備RNA中污染的微量雙鏈RNA所引起[2。將制備的RNA機(jī)制與一種名叫RNA依賴(lài)性RNA聚合酶有關(guān)。RNA依賴(lài)高度純化后發(fā)現(xiàn)，正義RNA無(wú)基因抑止作用，反義RNA性RNA聚合酶不僅可以擴(kuò)增雙鏈RNA，同時(shí)也可以擴(kuò)增的基因抑止作用也很弱;而用純化后的雙鏈RNA注射線小干擾RNA。隨機(jī)降解PCR模式的作用機(jī)制是: RNA依賴(lài)蟲(chóng)，卻能高效、特異地阻斷相應(yīng)基因地表達(dá)。此后，又性RNA聚合酶利用小干擾RNA鏈作為引物，以靶mRNA作在果蠅、錐蟲(chóng)、渦蟲(chóng)、無(wú)脊椎動(dòng)物、脊椎動(dòng)物、植物和為模板來(lái)合成新的雙鏈RNA。合成的雙鏈RNA分子被哺乳動(dòng)物細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了RNA干擾現(xiàn)象。Dicer水解。被Dicer水解釋放出的新的小干擾RNA又可以作為引物指導(dǎo)新- ~輪的雙鏈 RNA的合成和降解。人2 RNA 干擾的作用機(jī)制們?cè)诠?、真菌、線蟲(chóng)等細(xì)胞內(nèi)均檢測(cè)到這種RNA依賴(lài)近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，小干擾RNA是RNA干擾作用賴(lài)以性RNA聚合酶的活性，但在人類(lèi)細(xì)胞中還未見(jiàn)有類(lèi)似報(bào)發(fā)生的重要中間效應(yīng)分子。小干擾RNA具有特征性結(jié)構(gòu)，道41。即長(zhǎng)約21~25個(gè)核苷酸的特殊雙鏈RNA分子;小干擾3 RNA干擾的特點(diǎn)RNA的序列與所作用的靶序列具有同源性;小干擾RNA兩條單鏈末端為5，端磷酸和3，端羥基;每條單鏈的跟傳統(tǒng)的基因治療技術(shù)相比, RNA干擾在基因功能3，端均有2~3個(gè)突出的非配對(duì)的堿基@。和相關(guān)“ 中國(guó)煤化工優(yōu)勢(shì)。RNA干擾確切的作用機(jī)制目前還不是很清楚，兩種.8.1粗MH的反義鏈和正義鏈對(duì)介導(dǎo)CcNM H G連所起的作用尚不清楚。收稿日期: 2004-03-30作者簡(jiǎn)介:俞富軍(1975-),男，浙江紹興人，住院醫(yī)師，碩士生。3.2特異性RNA 干擾最顯著的特征就是只引起與雙-168一第35卷俞富軍，等: RNA干擾技術(shù)第2期.鏈RNA同源的mRNA降解，而對(duì)其他無(wú)關(guān)基因的表達(dá)不小功能研究。其中雙鏈RNA合成成本很高，雙鏈RNA轉(zhuǎn)影響。入宿主細(xì)胞效率以及其在宿主細(xì)胞中的穩(wěn)定性及RNA干3.3 高效性無(wú)論是在體內(nèi)還是體外實(shí)驗(yàn)中，僅需少擾作用效率均不確定。②體外轉(zhuǎn)錄法。這種方法采用量的雙鏈RNA就能有效地抑止靶基因表達(dá)，抑止效率在I7RNA聚合酶，以先合成的DNA鏈為模板分別轉(zhuǎn)錄合成低等動(dòng)物中大于90%，這表明雙鏈RNA介導(dǎo)的RNA干擾正義和反義RNA，將正義和反義RNA混合，再經(jīng)退火復(fù)是一個(gè)以催化放大的方式進(jìn)行的●性得到雙鏈RNA,從而使臺(tái)成雙鏈RNA的成本大大降低，3.4 雙鏈RNA長(zhǎng)度限制性 引發(fā)有效RNA干擾的雙鏈但這種方法與化學(xué)合成方法有相同的缺點(diǎn).③體內(nèi)載體RNA最短不得短于21個(gè)堿基，而且長(zhǎng)的雙鏈RNA也在細(xì)合成法。這是由P atrick等首先報(bào)道的利用載體在細(xì)胞內(nèi)被Dicer酶切割為21個(gè)堿基左右的小干擾RNA，并胞體內(nèi)穩(wěn)定地表達(dá)siRNA從而抑制哺乳動(dòng)物細(xì)胞靶基因由小干擾RNA來(lái)介導(dǎo)mRNA切割。表達(dá)的方法0.11。其基本思路如下:細(xì)胞內(nèi)存在RNA聚3.5 可傳播性RNA干擾有一種令人驚奇的跨越細(xì)胞合酶II，它可以識(shí)別U6啟動(dòng)子，從而使啟動(dòng)子后的基界限的能力，在果蠅細(xì)胞中可在細(xì)胞群落之間傳播。在因轉(zhuǎn)錄成RNA，當(dāng)模板連續(xù)出現(xiàn)3~5個(gè)T堿基時(shí)，轉(zhuǎn)錄線蟲(chóng)中可在局部注射雙鏈RNA而傳播到整個(gè)機(jī)體問(wèn)。就會(huì)終止。根據(jù)這一機(jī)制，可以設(shè)計(jì)一種能表達(dá)RNA的3.6 ATP依賴(lài)性 在去除ATP的樣品中，RNA千擾現(xiàn)象質(zhì)粒，其組成包括四個(gè)部分: a.常用質(zhì)粒的基本序列。降低或消失，表明RNA干擾是一個(gè)ATP依賴(lài)的過(guò)程。b、U6啟動(dòng)子，位于克隆位點(diǎn)的上游。C、克隆位點(diǎn)。d3.7轉(zhuǎn)錄后水平的 基因沉默機(jī)制注射 該基因的內(nèi)含RNA千擾模板序列。這部分序列具有如下特點(diǎn):含RNA子或者啟動(dòng)子順序的雙鏈RNA都沒(méi)有千涉效應(yīng)，翻譯抑干擾序列，對(duì)哺乳動(dòng)物而言通常為21~23個(gè)核苷酸;制劑對(duì)RNA干擾也不產(chǎn)生影響。發(fā)卡結(jié)構(gòu)環(huán)狀部分，通常有4~7個(gè)核苷酸;靶序列的反向互補(bǔ)序列: 3~5個(gè)核苷酸T.將具有如上結(jié)構(gòu)的質(zhì)4 RNA 的實(shí)驗(yàn)技術(shù)及其進(jìn)展粒導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，體內(nèi)的RNA聚合酶I就可以合成- - 條4.1小干擾 RNA序列設(shè)計(jì)方法在基因庫(kù)中 尋找靶向RNA鏈，這條RNA鏈可以通過(guò)兩端的21個(gè)左右的核苷酸基因mRXA序列，并從基因編碼序列的起始密碼子開(kāi)始反向互補(bǔ)特性而形成發(fā)卡樣雙鏈結(jié)構(gòu)，從而起到基因抑向下游尋找腺苷二核苷酸，標(biāo)記并選擇每個(gè)腺苷二核苷制作用。這種技術(shù)操作簡(jiǎn)便，使用成本低，與直接導(dǎo)入酸及其下游鄰近的19個(gè)核苷酸序列--起作為mRNA的靶小干擾RNA相比，DNA質(zhì)粒更易導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，而且質(zhì)粒序列。在設(shè)計(jì)小干擾RNA的過(guò)程中，要避開(kāi)mRNA的5'導(dǎo)入細(xì)胞后存在時(shí)間長(zhǎng)且穩(wěn)定，對(duì)靶基因的表達(dá)抑制效和3’非編碼區(qū)以及5'起始密碼區(qū)附近50~100個(gè)核苷率高，便于進(jìn)行較長(zhǎng)時(shí)間的基因功能研究，因而近日來(lái)酸的序列，因?yàn)樵谶@些區(qū)域含有豐富的蛋白結(jié)合位點(diǎn)，成為一種熱門(mén)技術(shù)。結(jié)合的調(diào)節(jié)蛋白以及形成的翻譯起始復(fù)合物等可以影響4.3 RNA干擾技術(shù)存在的問(wèn)題 目 前RNA干擾機(jī)制尚RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物結(jié)合到靶mRNA上間。為了選擇合適未完全闡明，尤其在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的報(bào)道不多，小千的小干擾RNA靶序列,必須將上述包括腺苷二核苷酸在擾RNA在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中抑制mRNA表達(dá)是有效的，但內(nèi)的21個(gè)核苷酸的序列，根據(jù)實(shí)驗(yàn)對(duì)象的不同,選擇不并不能像在果蠅細(xì)胞中那樣完全抑制目的基因的表達(dá)，同基因組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行全基因組描和序列同源分析，確可能是因?yàn)樯矬w是一個(gè)復(fù)雜的系統(tǒng),存在多種機(jī)制相保選擇的小干擾RNA序列與基因組中其他基因至少存在互作用以調(diào)控基因的表達(dá)。另外在哺乳動(dòng)物中RNA干擾3個(gè)以上的堿基不同，同時(shí)在進(jìn)行小干擾RNA或雙鏈RNA能否成功地抑制基因表達(dá)以及其抑制的程度還取決于細(xì)序列設(shè)計(jì)時(shí)要盡量沿靶基因序列多設(shè)計(jì)幾個(gè)不同序列，胞類(lèi)型。對(duì)線蟲(chóng)來(lái)說(shuō)可以采用注射、浸泡或喂食的方法通過(guò)轉(zhuǎn)染細(xì)胞選出效果最好的序列，因?yàn)閷?duì)于mRNA的轉(zhuǎn)入雙鏈RNA，而對(duì)哺乳動(dòng)物來(lái)說(shuō)，尋找高效的方式來(lái).不同區(qū)域序列同源的小干擾RNA產(chǎn)生的RNA干擾的效率轉(zhuǎn)入小干擾RXA以及快速的方式來(lái)篩選RNA干擾尚需進(jìn)是不同的。最后根據(jù)已經(jīng)設(shè)計(jì)的21個(gè)反義RNA序列合成-步 探索。RSA干擾在病毒感染中的應(yīng)用令人振奮，但2條RNA鏈，在其二鏈的3’末端最后2個(gè)核苷酸設(shè)計(jì)合中國(guó)煤化工A發(fā)生作用，有些病毒成dTdT序列，以減少細(xì)胞內(nèi)降解。靶YHCNMHG&者位于高度折疊的區(qū)4.2 小干擾RNA合成方法 ①體外化學(xué)合成方法。最域中，而有些病毒序列可能與蛋白質(zhì)形成緊密的復(fù)合為經(jīng)典的方法，共分四個(gè)步驟: a、化學(xué)合成雙鏈RNA。物，阻礙了與小千擾RNA的識(shí)別。因此不僅要選擇合適b、將雙鏈RNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞.c、檢測(cè)靶基因抑制效率。的靶序列，而且需要反復(fù)試驗(yàn)。為了克服這個(gè)障礙，所-169一第35卷溫州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)第2期選病毒RNA的靶序列必須是高度保守的，或者設(shè)計(jì)幾對(duì)有專(zhuān)家認(rèn)為RNA干擾現(xiàn)象的研究，可能是未來(lái)十年小干擾RNA同時(shí)作用于病毒。再者還需要注意有些病毒生物學(xué)領(lǐng)域中最激動(dòng)人心，也最有可能產(chǎn)生豐富成果的會(huì)產(chǎn)生較多的代謝產(chǎn)物，也可以影響小千擾RNA抗病毒領(lǐng)域之-。盡管目前RNA干擾技術(shù)在哺乳動(dòng)物中的應(yīng)用的效果。還處于探索階段,但它在斑馬魚(yú)和老鼠胚胎等脊椎動(dòng)物中的成功應(yīng)用，預(yù)示RNA干擾將成為疾病尤其是腫瘤基5 RNA干擾研究的應(yīng)用 前景因治療中重要的組成部分，人工合成的雙鏈RNA寡聚藥5.1 研究基因功能的新工具在對(duì)基因組進(jìn)行功能分析物的開(kāi)發(fā)將可能成為極具發(fā)展前途的新興產(chǎn)業(yè)。時(shí)，需要對(duì)特定基因進(jìn)行功能喪失或降低突變，以確定參考文獻(xiàn): .其功能。由于RNAi具有高度的序列專(zhuān)- -性，可沉默特異基因，因此被視為功能基因組研究的有力工具。Kamath[11 Guo S,Kemphues KJ.Par-I ,a gene required for establishingpolarity in C.elegans embryos,encodes a putative SerThr等用RNAi抑制蠕蟲(chóng)基因組中19427個(gè)基因中的86%，鑒kinase that is asymmetrically distributed [J]. Cell, 1995, 81定了1722個(gè)基因的突變亞型，其中有2/3的表型以往(4):611-620.未曾被注意門(mén)。同法抑制16757個(gè)編碼蛋白質(zhì)的預(yù)言基[21 Fire A,Xu S,Montgomery MK,et al. Potent and specific genetic因，其中許多基因與人類(lèi)同源，如50%以上的蠕蟲(chóng)脂肪interference by double- stranded RNA in Caenorhabditis elegans調(diào)節(jié)基因在哺乳動(dòng)物中有同源基因，對(duì)其進(jìn)行研究將有[].Nature,1998,3916669): 806 -811.助于發(fā)現(xiàn)人類(lèi)肥胖相關(guān)基因固,進(jìn)而治療肥胖或其相關(guān)[3] Zamore PD,Tuschl T,Sharp PA,et al.RNAi:double-strandedRNA directs the ATP-dependent cleavage of mRNA at21 to疾病。與傳統(tǒng)的基因敲除技術(shù)相比，這一技術(shù)具有投入23 nucleotide intervals []. l.l,00010(1):25- 33.少、周期短、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)勢(shì)，近來(lái)RNA干擾成功地用[4Pal- Bhadra M,Bhadra U,Birchler JA,et al.RNAi related mec-于構(gòu)建轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型的報(bào)道日益增多，標(biāo)志著RNA干hanisms affect both transcriptional and posttranscriptional擾將成為研究基因功能不可缺少的工具。transgene silencing in Drosophila [J.Mol Cell,2002, 9(2) :315- 327.5.2 研究信號(hào)傳導(dǎo)通路的新途徑 聯(lián)合利用傳統(tǒng)的缺失突變技術(shù)和RNA干擾技術(shù)可以很容易地確定復(fù)雜的信[5Caplen NJ,Fleenor J.,Fire A.et al.DsRNA-mediated gene si-lencing in cultured Drosophila cells: a tsse culture model號(hào)傳導(dǎo)途徑中不同基因的上下游關(guān)系。Clemensy 等應(yīng)for the analysis of RNA itrerenecelJ.ene.2000252(1-用RNA干擾研究了果蠅細(xì)胞系中胰島素信息傳導(dǎo)途徑，2):95- 105.取得了與已知胰島素信息傳導(dǎo)通路完全一致的結(jié)果，在[61McManus MT, Sharp PA. Gene silencing in mammals by small此基礎(chǔ)上分析了DSH3PX1與DACK之間地關(guān)系，證實(shí)了interfering RNAs[J].Nat Rev Genet,2002,3(10):737-747.DACK是位于DSH3PX1磷酸化的上游激酶9。RNA干擾技[7Kamath RS,Fraser AG,Dong Y,et al.System atic functiongalanalysis of the caenorhabditis elegans genome us ing RNAi術(shù)較傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)單、快速，重復(fù)性好，克服了轉(zhuǎn)[]. Nature,2003, 42(6920):231-237.染實(shí)驗(yàn)中重組蛋白特異性聚集和轉(zhuǎn)染效率不高的缺點(diǎn)，[8] Ashrafi K,Chang FY,Watts JL,et al.Genome wide RNAi ana-因此認(rèn)為RNA干擾技術(shù)將可能成為研究細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通lysis of caenorhabditis elegans genome using RNAilI].路的新途徑。Nature,2003, 421(6920):268-272.5.3 開(kāi)展基因治療的新策略RNA干擾具有抵抗病毒入[9] Moris JC.Wang Z.Drew ME,et al.Glycolysis modulates try-panosome glycoprotein expression as revealed by an RNAi侵、抑制轉(zhuǎn)座子活動(dòng)、防止自私基因序列過(guò)量增殖等作library[].EMBO J,2002.21(17):4429- 4438.用，因此可以利用RNA千擾現(xiàn)象抗擊人類(lèi)致病病毒。丙{101 Randall G,Grakoui A,Rice CM.Clearance of replicating型肝炎病毒是慢性肝病和肝細(xì)胞癌的主要致病因子,hepatitis C virus replic on RNAs in cell culture by smallRandall等以NSSB為靶位點(diǎn)合成siRNA轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞，interfering RNAs [J].Proc Natl Acad Sci USA, 2003, 100(1):235- 240.發(fā)現(xiàn)HCV RNA表達(dá)下降80倍101。Kapadia 等以非結(jié)構(gòu)Kapadia SB,Brideau Andersen A,.Chisari FV. Interference區(qū)為靶位點(diǎn)合成7個(gè)siRNA表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞，發(fā)of hepatits C virus RNA replication by short interfering現(xiàn)NS3和NS5B的mRNA水平下降21倍和23倍，有效地中國(guó)煤化工,1004):2014-2018.抑制了病毒復(fù)制川。本文編輯:胡苗苗)“YHCNMHG-170-