第28卷第3期南京師大學(xué)報(自然科學(xué)版)Vol 28 No. 32005年JOURNAL OF NANJING NORMAL UNIVERSITY( Natural Science)嗜熱厭氧產(chǎn)乙醇桿菌乙醇代謝邇徑的初步研究蔣字,邵蔚藍(lán)12(1.江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室,214036,江蘇,無錫)(2.南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,210097,江蘇,南京)[摘要]以乙醇產(chǎn)量和細(xì)胞密度的提高為目標(biāo),從碳源和氮源人手,對嗜熱厭氧產(chǎn)乙醇桿菌 Thermoanaerobacter ethanolicus JW200的培養(yǎng)基作了初步優(yōu)化以提高乙醇代謝途徑中的關(guān)鍵酶的得率,便于提純葡萄糖濃度的提高對乙醇的產(chǎn)生有明顯的誘導(dǎo)作用但當(dāng)葡萄糖濃度高于2%,乙醇產(chǎn)量反而下降酵母粉對乙醇產(chǎn)量沒有促進(jìn)作用,單純提高酵母粉濃度對細(xì)胞密度無顯著影響,而同時提高葡萄糖和酵母粉濃度至20%,OD最高可達(dá)2.0.2%葡萄糖,0.5%醉母粉對單位細(xì)胞乙醇產(chǎn)量的誘導(dǎo)效果最佳.T. ethanolicus JW200粗酶液中未檢測到丙酮酸脫羧酶的活性,經(jīng)親和柱 Cibacron blue3GA部分純化,在NAD洗脫蛋白中檢測到輔酶A依賴型乙醛脫氫酶的活性,表明輔酶A依賴型乙醛脫氫酶是該菌乙醇代謝途徑中的關(guān)鍵酶,它和乙醇脫氫酶共同作用,將乙酰輔酶A轉(zhuǎn)化成乙醇[關(guān)鍵詞]嗜熱厭氧產(chǎn)乙醇桿菌輔酶A依賴型乙醛脫氫酶葡萄糖酵母粉,乙醇[中圖分類號]Q939.1,[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A,[文章編號]1004616(2005)03006905Primary Study on Ethanol ProductionPathway in Thermoanaerobacter ethanolicusJiang Yu, Shao Weilan. 2(I. The Key Laboratory of Industrial Biotechnology under Ministry of Education, Southern Yangtze University, 214036, Wuxi, China(2. School of Life Science, Nanjing Normal University, 210097, Nanjing, China)Abstract: In order to induce the key enzymes of ethanol production pathway in Thermoanaerobacter ethanolicus JW200 for purification, the paper optimized the medium to increase the ethanol and cell yields. Fial ethanol production was obviously enhanced when increasing concentration of glucose, but no progresswas detected when glucose reached higher than 2%. No greater ethanol production or cell biomass wasbserved if simply increase concentration of yeast extract. The maximum ODooo reached 2. 0 when increasing glucose and yeast extract to 2. 0%. The best ethanol induction medium contained 2. 0% glucose and0. 5% yeast extract. Cell-free extracts were prepared from T, ethanolicus JW200, and no pyruvate decar-oxylase activity was detected in it. After partially purified by affinity chromatography Cibacron Blue3GA, CoA-acylating aldehyde dehydrogenase activity was detected in NAD elution proteins. The resultsndicated CoA-acylating aldehyde dehydrogenase was the key enzyme in ethanol production pathway of T.ethanolicus JW200, which convert acetyl-CoA to aldehyde, and then to ethanol by alcohol dehydrogenasey words: Thermoanaerobacter ethanolicus, CoA-acylating aldehyde dehydrogenase, glucose, yeast extract. ethan0引言嗜熱厭氧細(xì)菌通常能直接利用一些廉價的底物,如纖維素、半纖維素以及淀粉,是一種有很大開發(fā)收稿日期:20050226基金項目:國家自然科學(xué)基金資助項目(30170511)宇,女,1978-,博士研究生,主要從事微生物基因工程的學(xué)習(xí)與研究E-mail:biojiangyut@163.com南京師大學(xué)報(自然科學(xué)版)第28卷第3期(2005潛力的生產(chǎn)工業(yè)乙醇的微生物隨著全球油價的持續(xù)攀升,對嗜熱厭氧細(xì)菌乙醇代謝途徑的研究有著深遠(yuǎn)的經(jīng)濟(jì)意義和科學(xué)意義嗜熱厭氧產(chǎn)乙醇桿菌 Thermoanaerobacter ethanolicus JW200是從熱泉區(qū)分離得到的嗜熱厭氧桿菌,能在37~8℃,pH4.4~9.8范圍生長,最適生長條件是69℃,pH5.8~8.5,是產(chǎn)乙醇能力最強(qiáng)的極端微生物該菌底物范圍廣,能廣泛利用五碳糖和六碳糖,乳糖、蔗糖、麥芽糖、纖維二糖、丙酮酸和淀粉,不能利用纖維素.當(dāng)?shù)孜餄舛刃∮?%時,以乙醇和CO2為主要發(fā)酵產(chǎn)物2常用的乙醇生產(chǎn)菌的乙醇代謝途徑以釀酒酵母和運動發(fā)酵單孢菌為代表,后者通過丙酮酸脫羧酶和乙醇脫氫酶將丙酮酸轉(zhuǎn)化成乙醇3,細(xì)菌中還存在另外一條乙醇代謝途徑,其中輔酶A依賴型乙醛脫氫酶和乙醇脫氫酶是乙醇代謝途徑關(guān)鍵酶,比如大腸桿菌,嗜熱細(xì)菌中的乙醇代謝途徑以 Clostridium thermycelium和 Thermoanaerobacter rockii之類的細(xì)菌為代表,前者只含I型乙醇脫氫酶( Primary alcohol dehydrogenase,P-ADH),而后者同時含Ⅰ型乙醇脫氫酶和Ⅱ型乙醇脫氫酶( Secondary alcohol dehydrogenase,sADH)③,I型乙醇脫氫酶和Ⅱ型乙醇脫氫酶以分別對正醇類和異醇類的強(qiáng)親和力為區(qū)別 Bryant等人80年代初從天然菌株中提純并分析了和Ⅱ型乙醇脫氫酶6),I型乙醇脫氫酶已被克隆本文從碳源和氮源入手,以乙醇產(chǎn)量和細(xì)胞密度的提高為目標(biāo)對嗜熱厭氧產(chǎn)乙醇桿菌做了初步培養(yǎng)基優(yōu)化以提高乙醇代謝途徑中的關(guān)鍵酶的得率,便于提純;并分析了嗜熱厭氧產(chǎn)乙醇桿菌乙醇代謝途徑中的關(guān)鍵酶,初步擬定了該菌的乙醇代謝途徑1材料和方法1.1菌株嗜熱厭氧產(chǎn)乙醇桿菌 Thermoanaerobacter ethanolicus JW200(ATCC31550)由美國佐治亞大學(xué)微生物系J. Wiegel實驗室惠贈.1.2主要試劑乙酰輔酶A、NAD、NADH購自 Roche公司;二硫蘇糖醇、疊氮鈉、乙醇脫氫酶ADH、半胱氨酸鹽酸鹽、所有維生素購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司;親和柱填料 Cibacron Blue3CA、刃天青購自 Sigma公司1.3培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件嗜熱厭氧產(chǎn)乙醇桿菌基本培養(yǎng)基配方(ATCC1190):0.15%KH2PO4;0.42%Na2HPO4·12H2O;0.05%NH4Cl;0.05%(NH4)SO4;0.018%MgC2·6H2O;0.2%酵母粉( Oxoid);0.8%葡萄糖;0.5mL/L維生素溶液;5 mL/L Wolfe' s Modified Mineral Elixir;lmL/L0.1% Resazurin;40μLL還原劑還原劑配方:NaOH(0.2mo/L)200mL;Na2S·9H2O2.5g; Cysteine HCl.H2O2.5g.NaOH煮沸同時充N2,稍冷卻加Na2S和 Cysteine,密封后高壓滅菌,12l℃,20min.培養(yǎng)基煮沸充氮排氧,稍冷卻加還原劑,分裝預(yù)先充氮的厭氧菌培養(yǎng)管或血清瓶,密封滅菌用無菌注射器按1%接種在厭氧菌培養(yǎng)管活化-70℃保藏菌種,69℃靜置培養(yǎng).1.4細(xì)胞密度培養(yǎng)過程中用注射器取樣,用分光光度計在600mm處讀數(shù).為排除氧指示劑的讀數(shù)干擾,操作熟練后培養(yǎng)基里可以不加刃天青指示劑1.5乙醇產(chǎn)量測定培養(yǎng)基中乙醇濃度的測定采用氣相色譜法,安捷倫1490氣相色譜儀,d3×1不銹鋼柱,滬產(chǎn)401有機(jī)擔(dān)體(規(guī)格CC60~80目),載氣:氮氣,柱溫140℃,檢測器溫度200℃,進(jìn)樣溫度200℃1.6培養(yǎng)基的部分優(yōu)化1.6.1糖濃度對乙醇產(chǎn)量的影響在基本培養(yǎng)基中依次加入葡萄糖至終濃度0.8%,1,0%,1.2%,1,6%,2,0%,2.4%,2.8%,平行培養(yǎng)40h,分別在20h,30h,40h取樣測定細(xì)胞密度,并測定培養(yǎng)40h培養(yǎng)基乙醇終濃度1.6.2碳源和有機(jī)氮源對乙醇產(chǎn)量的影響蔣宇,等:嗜熱厭氧產(chǎn)乙醇桿菌乙醇代謝途徑的初步研究0.5%酵母粉;1%葡萄糖,2%酵母粉;2%葡萄糖,0.5%酵母粉;%葡萄糖,2%酵母粉.平行培養(yǎng)40h,分別在20h,30h,40h取樣測定細(xì)胞密度,并測定培養(yǎng)40h培養(yǎng)基乙醇終濃度1.7嗜熱厭氧產(chǎn)乙醇桿菌的固體培養(yǎng)在不含還原劑和葡萄糖的優(yōu)化培養(yǎng)基里加2.5%的瓊脂粉,121℃,40min高壓滅菌后在厭氧工作臺( Shellac公司)里加無菌還原劑和葡萄糖,待指示劑顏色退去后分裝預(yù)先滅菌的厭氧管每管4mL和厭氧瓶,凝固后密封4℃保存鋪平板前將活化后的菌液和厭氧管中融化的4mL培養(yǎng)基在厭氧臺里混勻,均勻地平鋪在預(yù)先鋪好底層培養(yǎng)基的厭氧瓶里,65℃倒置培養(yǎng)48h.1.8柱層析和乙醇代謝途徑關(guān)鍵酶的酶活測定1.8.1丙酮酸脫羧酶的測定細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)生長后期至平衡期冰浴停止培養(yǎng),4℃,8000r/min,10min離心收集細(xì)胞.dH2O洗滌細(xì)胞2次,用20mmol/ L Tris- HCl pH8.0, 1 mmol./LDT,o.02%NaN3重懸細(xì)胞高壓細(xì)胞破碎儀破碎細(xì)胞,1,2×103kPa,2次粗酶液14000r/min,4℃,離心1h,取上清用緩沖液A(20mmol/ L Tris-HClpH8. 0, 150 mmol/L NaCl, I mmol/L DTT, 0. 02% NaN,)itT酶活測定標(biāo)準(zhǔn)步驟:2mL緩沖液含25 mmoL/L MOPS(pH6.5),1mmol/L焦磷酸硫胺素,1,5 mmol/LMgCl2,1 mmol/L NADH;加透析后粗酶液40μL,50℃,平衡30min;加底物內(nèi)酮酸鈉至終濃6mmoL,50℃,反應(yīng)30min;冰浴迅速中止反應(yīng),補(bǔ)加NADH3mmo/L,分裝兩個比色杯各1mL,一份加入乙醇脫氫酶(300U/mg)ADH3U/mL,另一份加入等體積dH2O為空白對照,室溫反應(yīng)30min;分光光度計340mm處讀數(shù),計算相對于空白對照的下降值.以1μmol/min還原NADH為一個酶活單位以運動發(fā)酵單孢菌丙酮酸脫羧酶的大腸桿菌重組菌粗酶液作陽性對照,酶活測定步驟同上1.8.2親和層析親和柱填料 Cibacron blue-3GA用去離子水溶漲過夜后裝柱,用緩沖液A平衡8~10個柱體積透析后粗酶液上柱,0.5ml/min,緩沖液A洗滌8~10個柱體積將未結(jié)合的蛋白徹底洗盡,在2個柱體積緩沖液A中加入4mmo/L的NAD洗脫.親和柱可用2 mol/L NaCl清洗并保存1.8.3輔酶A依賴型乙醛脫氫酶的測定親和柱NAD洗脫蛋白70%硫酸胺沉淀,后用20mmol/ L Tris-HCI(pH7.5),1mmoL二硫蘇糖醇0.02%疊氮鈉,20%甘油透析;-20℃冰凍保存酶活測定標(biāo)準(zhǔn)體系:1mL標(biāo)準(zhǔn)體系含50 mmol/L Tris-HCI(pH8.0),0.5mmo/ L NADH,5mmo/L二硫蘇糖醇,0.5 mmoL/L乙酰輔酶A,親和柱NAD洗脫蛋白100μL,60℃反應(yīng)30min,冰浴終止反應(yīng),分光光度計340mm處讀數(shù),計算相對于空白對照的下降值空白對照加等體積的dH2O代替底物乙酰輔酶A以1μ mol/ min的速率還原NADH為一個酶活單位2結(jié)果2.1糖濃度對細(xì)胞密度和乙醇產(chǎn)量的影響根據(jù)預(yù)實驗,在基本培養(yǎng)基中加入葡萄糖至終濃1%和3%,平行培養(yǎng),分別在20h,30h,40h,50h取樣測定細(xì)胞密度和培養(yǎng)基乙醇含量,確定代謝產(chǎn)物乙醇累積至平衡的最短培養(yǎng)時間為40h,故確定優(yōu)化實驗的培養(yǎng)時間為如圖1所示,糖濃度的增加對乙醇產(chǎn)量的提高有明顯的誘導(dǎo)作用,但對細(xì)胞密度基本沒有影響當(dāng)葡萄糖濃度是2%時乙醇產(chǎn)量最高.當(dāng)葡萄糖濃度繼續(xù)增髙,乙醇產(chǎn)量又開始回落.2.2碳源和有機(jī)氮源對細(xì)胞密度和乙醇產(chǎn)量的影響如圖2所示,合適的碳氮比對細(xì)胞密度有很大的影響.以0152.51%葡萄糖為碳源,單純的將酵母粉從0.5%提高到2%,并沒葡萄糖濃度%有提高細(xì)胞密度,可能是由于碳氮比的失調(diào)造成的;同樣對乙圖1糖濃度對細(xì)胞密度和乙醇產(chǎn)量的影響南京師大學(xué)報(自然科學(xué)版)第28卷第3期(2005年)而單純提高糖濃,也不會提高細(xì)胞密度,但能誘導(dǎo)乙醇的產(chǎn)生.同時提高葡萄糖和酵母粉的濃度,能大幅提高細(xì)胞密度,培養(yǎng)基乙醇的終濃也達(dá)到最高,而從圖3可以看出這部分的乙醇是由于細(xì)胞密度的提高而貢獻(xiàn)的.以乙醇產(chǎn)量除以最高細(xì)胞密度作為縱坐標(biāo),也就是將每個細(xì)胞的產(chǎn)乙醇量進(jìn)行比較,2%葡萄糖0.5%酵母粉能達(dá)到乙醇產(chǎn)量的最佳誘導(dǎo)效果口細(xì)胞密度,乙醇濃度1.10%葡萄糖,05%酵母粉1.10%葡萄糖,05%酵母粉2.1.%萄糖,20%酵母粉2.1.%葡萄糖,2.0%酵母粉3.20%葡萄糖,0.5%酵母粉3.20%葡萄糖,0.5%酵母粉4.2.0%葡萄糖,20%酵母粉4.2.0%葡萄糖,20%酵母粉圖2葡萄糖和酵母粉濃度對細(xì)胞密度和乙醇產(chǎn)量的影響圖3葡萄糖和酵母粉濃度對單位細(xì)胞乙醇產(chǎn)量的影響2.3嗜熱厭氧產(chǎn)乙醇桿菌的固體培養(yǎng)根據(jù)培養(yǎng)基優(yōu)化的結(jié)果,2%葡萄糖,2%酵母粉最有利于細(xì)胞生長,故采用此培養(yǎng)基作固體培養(yǎng).采用雙層培養(yǎng)法可有效避免因高溫下培養(yǎng)基表面脫水嚴(yán)重導(dǎo)致的表面菌落生長不穩(wěn)定,也可避免冷凝水對表面菌落生長的干擾,能獲得穩(wěn)定的單菌落.36h即可看到透明的單菌落(圖4),培養(yǎng)基表面菌落較淺表層菌落生長快速,菌落直徑最大可達(dá)1.5mm.2.4乙醇代謝途徑關(guān)鍵酶的酶活檢測圖4嗜熱厭氧產(chǎn)乙醇桿菌的固體培養(yǎng)由于粗酶液中蛋白種類很多,且含部分不能用透析去除的細(xì)胞破碎液中的天然底物,有關(guān)NADNADH氧化還原的酶對酶活測定有干擾,所以先用NADH平衡至本身的天然底物耗盡后,再加底物內(nèi)酮酸并補(bǔ)加NADH,高溫下反應(yīng);由于購買的ADH是常溫酶故加ADH后的第二步反應(yīng)在常溫下進(jìn)行,空白對照不加ADH,加等體積的ddH2O.我們在粗酶液中未檢測到丙酮酸脫羧酶的活性,而同時我們能測到陽性對照運動發(fā)酵單孢菌的丙酮酸脫羧酶的酶活為0.36U/mg.由此證明嗜熱厭氧產(chǎn)乙醇桿菌中不存在丙酮酸脫羧酶我們嘗試直接用粗酶液測定乙醛脫氫酶的酶活未成功,因為受到其它有關(guān)NAD/NADH氧化還原的酶的干擾. Cibacron blue-3GA是一種以染料為配基的填料,能結(jié)合核酸輔助因子、脫氫酶、激酶、限制性內(nèi)切酶、白蛋白、干擾素等.用NAD能特異性洗脫所有以NAD/NADH作為輔酶的蛋白.根據(jù)這個原理,乙醛脫氫酶能被結(jié)合,且能被NAD洗脫.我們在NAD洗脫蛋白中檢測到乙醛脫氫酶的酶活為0.23U/mg,由此可見乙醛脫氫酶是該菌乙醇代謝途徑中的關(guān)鍵酶3討論嗜熱厭氧桿菌是產(chǎn)乙醇能力最強(qiáng)的極端微生物,它的乙醇代謝途徑是不同于常用的乙醇生產(chǎn)菌,如釀酒酵母和運動發(fā)酵單孢菌.常溫細(xì)菌,以運動發(fā)酵單孢菌為例,丙酮酸脫羧酶和乙醇脫氫酶是乙醇代謝途徑中的關(guān)鍵酶,它們能將丙酮酸直接轉(zhuǎn)化成乙醛,再轉(zhuǎn)化成乙醇3.但迄今為止,還未在嗜熱菌中發(fā)現(xiàn)過丙酮酸脫羧酶.因此,熱穩(wěn)定性的丙酮酸脫羧酶仍然是現(xiàn)今科學(xué)界的研究熱點.根據(jù)本文的實驗結(jié)果和Bryant等人的硏究結(jié)果③6,我們可以推測嗜熱厭氧產(chǎn)乙醇桿菌的乙醇代謝途徑的關(guān)鍵酶是輔酶A依賴型乙醛脫氫酶和乙醇脫氫酶,它們能將乙酰輔酶A轉(zhuǎn)化成乙醛,再生成乙醇.這條途徑也是嗜熱細(xì)菌乙醇蔣宇,等:嗜熱厭氧產(chǎn)乙醇桿菌乙醇代謝途徑的初步研究由于無法在培養(yǎng)過程中利用粗酶液直接跟蹤乙醛脫氫酶的酶活,我們以乙醇終產(chǎn)量和細(xì)胞密度的提高為目標(biāo)對培養(yǎng)基進(jìn)行初步優(yōu)化,以確定高乙醇產(chǎn)量的誘導(dǎo)條件,進(jìn)而提高乙醇代謝途徑中的一系列關(guān)鍵酶的得率,便于提純.結(jié)果表明,髙糖對乙醇的產(chǎn)生有明顯的誘導(dǎo)作用,但高于2%乙醇產(chǎn)量又開始回落,可能此時代謝主要轉(zhuǎn)向有機(jī)酸的產(chǎn)生酵母粉對乙醇的產(chǎn)生沒有促進(jìn)作用,但對細(xì)胞密度的提高有明顯作用據(jù)報道,酵母粉對嗜熱厭氧產(chǎn)乙醇桿菌的生長有著不可替代的作用2.丙酮酸脫羧酶的酶活是用間接測定下一步乙醇脫氫酶的活性來測定的,而乙醇脫氫酶和輔酶A依賴型乙醛脫氫酶的酶活的測定又是介于NAD/NADH的氧化還原,故受到其它和NAD/NADH相關(guān)酶的干擾,因此,在粗酶液中直接測定丙酮酸脫羧酶和乙醛脫氫酶的活性比較困難.本文用親和柱部分純化粗酶液進(jìn)行酶活測定獲得成功.本文的硏究結(jié)果為對其進(jìn)行進(jìn)一步深入研究奠定了基礎(chǔ)[參考文獻(xiàn)][1] Lovitt R W, Shen G J, Zeikus J G. 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